Grün „umdrehen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 14131 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Nitazoxanid (NTX) ist ein antimikrobielles Medikament, das zur Behandlung verschiedener Protozoen eingesetzt wurde. Während der Coronavirus-Pandemie wurde NTX jedoch zur Behandlung solcher Viren eingesetzt, die hauptsächlich die Atemwege infizieren. NTX wird heute als antivirales Breitbandmittel eingesetzt. In dieser Studie wurde eine hochempfindliche und umweltfreundliche spektrofluorometrische Methode entwickelt, um NTX in verschiedenen Dosierungsformen und seinen Metaboliten Tizoxanid (TX) in menschlichen Plasmaproben mithilfe von mit Stickstoff und Schwefel codotierten Kohlenstoff-Quantenpunkt-Nanosensoren (C-Dots) nachzuweisen. Mit einer einfachen und umweltfreundlichen hydrothermischen Methode wurden wasserlösliche C-Punkte aus Zitronensäure und L-Cystein synthetisiert. Nach Anregung bei 345 nm wurde die Lumineszenzintensität bei 416 nm gemessen. Die Lumineszenz der C-Punkte wurde bei Zugabe von NTX gelöscht und war proportional zur NTX-Konzentration. Die Bewertung des Löschmechanismus wurde durchgeführt, um zu beweisen, dass der innere Filtereffekt der zugrunde liegende molekulare Mechanismus der erzielten NTX-Löschung ist. Nach der Optimierung aller experimentellen Parameter wurde das Analyseverfahren anhand der ICH-Richtlinien evaluiert und validiert. Die Methodenlinearität sowie die Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen von NTX lagen bei 15 × 10–3–15,00 µg/ml, 56,00 × 10–4 bzw. 15 × 10–3 µg/ml. Die vorgeschlagene Methode wurde zur Bestimmung von NTX in seinen kommerziellen pharmazeutischen Produkten angewendet; Nanazoxid® Suspension und Tabletten zum Einnehmen. Die ermittelte prozentuale Wiederfindung, die relative Standardabweichung und der prozentuale relative Fehler waren zufriedenstellend. Der Vergleich mit anderen berichteten spektrofluorimetrischen Methoden zeigte die überlegene Empfindlichkeit der vorgeschlagenen Methode. Diese hohe Empfindlichkeit ermöglichte die selektive Bestimmung von TX, dem Hauptmetaboliten von NTX, in menschlichen Plasmaproben. Damit ist diese Studie die erste spektrofluorimetrische Methode in der Literatur, die TX in menschlichen Plasmaproben bestimmt. Darüber hinaus wurde die Grünheit der Methode mithilfe der Eco-Scale- und AGREE-Ansätze bewertet, um die Überlegenheit der vorgeschlagenen Grünheit der Methode gegenüber anderen zuvor veröffentlichten spektrofluorimetrischen Methoden zur Analyse von NTX und seinem Metaboliten TX in verschiedenen Dosierungsformen und in menschlichen Plasmaproben zu beweisen .

Nitazoxanid (NTX), (2-[(5-Nitro-1,3-thiazol-2-yl)carbamoyl]phenyl]acetat) (Abb. 1a) ist ein synthetisches orales Breitband-Antiparasitikum, das erstmals in der USA synthetisiert wurde 1980er Jahre. NTX hat sich als wirksam gegen menschliche Helminthen, Darmprotozoen, anaerobe Bakterien und Viren erwiesen. Es wird zur Behandlung von Infektionen eingesetzt, die durch Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia oder Clostridium difficile1,2,3,4 verursacht werden. Es wird auch als Einzelmedikament zur Behandlung von Helicobacter pylori-Bakterien verabreicht5. Sowohl RNA- als auch DNA-Viren sind sehr anfällig für ihre Aktivität, wie z. B. Hepatitis B und C, Influenza A und Coronaviren (MERS, SARS, SARS-CoV-2)6,7. Darüber hinaus wurden seit der Erklärung des Coronavirus als weltweite Pandemie durch die WHO am 12. März 20208 verschiedene Studien durchgeführt, um seine Wirksamkeit bei der Behandlung von COVID-19 zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass Remdesivir und NTX bei der Behandlung von akutem SARS zusammenarbeiten. Eine CoV-2-Infektion verbessert die Virusclearance und senkt das Risiko einer Resistenzentwicklung9. Andererseits wurde nachgewiesen, dass die NTX/Azithromycin-Kombination den lebensbedrohlichen Zytokinsturm behandelt10. Auch die Verwendung von NTX, Ribavirin und Ivermectin zusätzlich zu Zinkkapseln zur Behandlung von COVID19 entfernte SARS-COV2 wirksamer und schneller aus dem Nasopharynx als eine symptomatische Therapie11. NTX scheint in der Schwangerschaft gegen SARS-CoV-2 wirksam zu sein, ohne unerwünschte Nebenwirkungen für den Fötus zu verursachen7. Im Hinblick auf den ursprünglichen SARS-CoV-2-Wuhan-Spike und mehrere neu entwickelte Varianten, wie z. B. die Delta-Variante, konnte NTX die Viruslast deutlich reduzieren12 und erwies sich somit als sichere und erschwingliche Behandlung für COVID-19.

(A) Chemische Strukturen von Nitazoxanid (NTX), (B) Anregung (durchgezogene Linie) und Emissionsspektren (gestrichelte Linie) von C-Punkten in Gegenwart (rote Linie) und in Abwesenheit (schwarze Linie) von 5 µg/ml NTX (λ-Emission = 416 nm und λ-Anregung = 345 nm) und (C) UV-sichtbares Absorptionsspektrum von C-Punkten.

Eine kürzlich durchgeführte Literaturrecherche ergab, dass viele Analysetechniken zur Quantifizierung von NTX eingesetzt wurden, wie z. B. Spektrophotometrie13,14,15, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)16,17, Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)18, und elektrochemisch unter Verwendung der voltammetrischen Technik19. Optisch weist NTX einen Absorptionspeak bei 345 nm auf, besitzt jedoch keine native Fluoreszenz. Nach unserem besten Wissen wurden zwei spektrofluorimetrische Studien zur Quantifizierung von NTX veröffentlicht. Abdel-Lateef et al.20 haben NTX in Tabletten oder seinen Metaboliten in menschlichen Urinproben mithilfe von Natriumhypochlorit bestimmt, das NTX zu einem stark fluoreszierenden Produkt oxidiert. Währenddessen haben Qandeel et al.21 pflanzensynthetische Quantenpunkte für die Analyse von NTX in Kapsel-Darreichungsformen verwendet.

Fluoreszierende Kohlenstoffquantenpunkte sind einzigartige Nanosensoren mit größenabhängigen optischen und elektrischen Eigenschaften22. Kohlenstoffpunkte haben aufgrund ihrer einzigartigen optischen Eigenschaften, ihrer extrem geringen Größe und ihres hohen Oberflächen-Volumen-Verhältnisses deutliche Vorteile, wie z. B. eine einstellbare starke Fluoreszenz vom tiefen Ultraviolett bis zum nahen Infrarot, Stabilität gegen Photobleichung und Photoblinzeln. Darüber hinaus sind sie dazu in der Lage absorbieren Licht mit einer breiten Bandbreite und emittieren es mit einem schmalen Spektrum. Kohlenstoffpunkte sind chemisch inert, umweltfreundlich und resistent gegen metabolische Zersetzung in Bioanwendungen. Sie sind im Vergleich zu herkömmlichen Punkten auf Halbleiterbasis auch nur geringfügig gefährlich23,24. Für die Synthese fluoreszierender Kohlenstoffquantenpunkte wurden viele beschriebene Methoden verwendet, darunter: chemische Oxidation25,26, hydrothermale Schneidstrategien27, elektrochemische Oxidation28,29, Karbonisierung aus organischen Stoffen30,31 und mikrowellenunterstütztes Verfahren21. Die meisten der oben genannten Methoden erfordern jedoch eine komplizierte Ausrüstung, schwierige Verfahren und brachten keine hohe Ausbeute, sodass sie nicht bevorzugt werden.

Bis heute wurden in zahlreichen Veröffentlichungen in der Literatur Kohlenstoffpunkte verwendet, die durch kreative Methoden in vielen pharmazeutischen Anwendungen synthetisiert wurden. Dazu gehört die Verwendung grüner, in einem Topf synthetisierter Stickstoff- und Schwefel-codotierter Kohlenstoffquantenpunkte für die Bestimmung von Salinomycin und Maduramicin in Lebensmittelproben32. Mikrowellenunterstützt hergestellte stickstoffdotierte Kohlenstoffquantenpunkte, die für die zelluläre Bildgebung und den Nachweis von Palbociclib in lebenden Krebszellen verwendet werden33. Hydrothermale Stickstoff- und Schwefel-dotierte Kohlenstoffquantenpunkte im Eintopfverfahren zur Bestimmung von Olanzapin und Diazepam in biologischen Flüssigkeiten, Dosierungsformen und zur Anwendung bei der Prüfung der Inhaltsgleichmäßigkeit34. Ein grüner mikrowellenunterstützter synthetisierter stickstoffdotierter Kohlenstoffquantenpunkt unter Verwendung von Orangensaft als Kohlenstoffquelle und Harnstoff als Stickstoffquelle zur Quantifizierung des Krebsmedikaments Dacomitinib in großen Mengen und in einer pharmazeutischen Dosierungsform35. Zitronensäure und Thiosemicarbazid wurden als Vorläufer für die hydrothermale Herstellung von mit Schwefel und Stickstoff dotierten Kohlenstoffquantenpunkten für die spektrofluorimetrische Schätzung von Gliclazid und Saxagliptin36, einigen nitrohaltigen Verbindungen37 und anderen Anwendungen38 verwendet.

In dieser Studie wurden mit Stickstoff und Schwefel co-dotierte Quantenpunkte (C-Punkte) aus Zitronensäure und L-Cystein über eine einfache einstufige hydrothermale Methode synthetisiert, bei der Zitronensäure als Kohlenstoffquelle und L-Cystein als Quelle dienen von Stickstoff und Schwefel24. Die synthetisierten C-Punkte wurden erfolgreich zur empfindlichen Bestimmung von NTX in verschiedenen Dosierungsformen und Tizoxanid (TX), dem Hauptmetaboliten von NTX, in menschlichen Plasmaproben eingesetzt. NTX wird nach oraler Verabreichung beim Menschen durch Deacetylierung sofort und vollständig zu einem aktiven Metaboliten TX metabolisiert17,39. Außerdem ist TX der einzige im Stuhl nachgewiesene Metabolit (zwei Drittel der NTX-Dosis). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass TX die einzige Spezies ist, die durch Inkubation mit menschlichen Mikrosomen erhalten wurde39. Nach Verabreichung einer oralen Dosis von 500 mg NTX weist TX eine Cmax von 1,9 mg/L auf; zwei bis sechs Stunden nach der Dosierung und eine terminale Halbwertszeit zwischen 1,03 und 1,6 h40. Nach unserem Kenntnisstand wurde bisher keine spektrofluorimetrische Methode zur Bestimmung von TX in menschlichen Plasmaproben beschrieben. Die vorgeschlagene Methode war einfach und hoch reproduzierbar für die Quantifizierung von NTX und TX mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit. Diese hohe Empfindlichkeit ermöglichte die einfache Bestimmung von TX in menschlichen Plasmaproben. Darüber hinaus war die Entwicklung umweltfreundlicher Analysemethoden in letzter Zeit einer der Hauptschwerpunkte der Forschung41,42,43,44,45,46. Zu diesem Zweck wurden das analytische Eco-Scale-Protokoll47 und der analytische GREEnness-Ansatz (AGREE)48 verwendet, um die Umweltverträglichkeit der vorgeschlagenen Methode zu klären, insbesondere im Hinblick auf den Energieverbrauch, die Entstehung von Abfall und gefährlichen Chemikalien. Nach einem Vergleich der vorgeschlagenen Methode mit anderen berichteten spektrofluorimetrischen Methoden zur Analyse von NTX zeigte sich, dass unsere vorgeschlagene Methode eine bessere Empfindlichkeit für die Bestimmung von NTX aufweist und den Vorteil hat, dass sie einfacher, kostengünstiger und umweltfreundlicher ist. Daher kann unsere vorgeschlagene Methode problemlos zur Qualitätskontrolle und Bioverfügbarkeit als einfaches, umweltfreundliches und effizientes Analysewerkzeug eingesetzt werden.

Nitazoxanid (NTX) wurde vom medizinischen Unternehmen Alandalous, Ägypten, geliefert. Seine Reinheit wurde mit (99,7 ± 0,72 %) zertifiziert. Wasserfreie Zitronensäure (99,9 %) und L-Cystein (98 %) wurden von Loba-Chemie (Mumbai, Indien) bezogen. Borsäure, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumhydroxid, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Methanol, Ethanol, Aceton, Isopropylalkohol und Acetonitril in analytischer Qualität wurden von der Chemiefirma El-Nasr, Kairo, Ägypten, bezogen. Oberflächenaktive Mittel, Cetrimid, Tween 80 und Natriumdodecylsulfat wurden von Sigma Aldrich, Deutschland, geliefert. Plasmaproben wurden freundlicherweise vom El-Shatby-Universitätskrankenhaus, Blutbank, Alexandria, Ägypten, zur Verfügung gestellt und bis zur Verwendung gefroren gelagert. Während der gesamten Arbeit wurde frisches entionisiertes Wasser verwendet. Bei den an dieser Studie beteiligten pharmazeutischen Präparaten handelt es sich um eine Nanazoxid®-Suspension zum Einnehmen mit der Aufschrift „100 mg NTX/5 ml“ und Nanazoxid®-Filmtabletten mit der Aufschrift „500 mg NTX“ (Utopia Company for Pharmaceuticals Industry, Kairo, Ägypten).

Spektrofluorometrische Messungen wurden mit einem Cary Eclipse Fluoreszenzspektrophotometer (Agilent Technologies, USA (Modell: G9800A)) durchgeführt. Das Instrument war mit einer 1-cm-Quarzzelle und einer 150-W-Xenonlampe ausgestattet. Es wurde ein UV-Vis-Lichtspektrophotometer von Shimadzu (USA-Modell 1800) verwendet und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopiespektren (FT-IR) unter Verwendung von Cary 360 FT-IR (Agilent Technologies, USA) gemessen. Mit dem Elektronenmikroskop TEM-1400 plus wurde die Morphologie der synthetisierten C-Punkte untersucht. Bei der Synthese des Kohlenstoffpunktreagenzes wurden auch ein Heratherm OGS60-Thermoofen und ein hydrothermischer Autoklavenreaktor mit 100 ml PTFE der Güteklasse A 316 aus Edelstahl verwendet. Zusätzlich Zentrifuge PLC-Serie. Modell: PLC-03, Leistung: 220 V/50 Hz; 0,65 A. Gemmy Industriepflanze. wurde benutzt. Alle pH-Messungen wurden mit Crison Instruments SA (Barcelona, ​​Spanien) aufgezeichnet und die Ultraschallbehandlung erfolgte mit einem Ultraschallgerät mit Soltec-Soluzioni-Technologie (Italien, Modell: 2200EP). Alle fluorimetrischen Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

Wasserfreie Zitronensäure (1,82 g, 9,5 mmol/L) und L-Cystein (1 g, 8,3 mmol/L) wurden in 10 ml entionisiertem Wasser gelöst und die Mischung dann 12 Stunden lang bei 70 °C eingedampft, um a zu erzeugen dicker Sirup. Dieser dicke Sirup wurde dann in einen 100 ml fassenden, mit Teflon ausgekleideten hydrothermischen Autoklavenreaktor aus rostfreiem Stahl überführt. Anschließend wurde die Mischung hydrothermisch in einem Heizofen 3 Stunden lang mit einer Geschwindigkeit von 10 °C min−1 auf 200 °C erhitzt. Anschließend ließ man die Reaktionsmischung mehrere Stunden bei Raumtemperatur abkühlen und das schwarze Sirupprodukt wurde mit 1 M NaOH-Lösung neutralisiert und mit entionisiertem Wasser auf 100 ml verdünnt. Schließlich wurde es vor der Filtration 5 Minuten lang bei Raumtemperatur ultraschallbehandelt24.

Die NTX-Stammlösung (500 μg/ml) wurde in Acetonitril hergestellt. Als grünes Lösungsmittel wurde entionisiertes Wasser verwendet, um die Arzneimittellösung zu verdünnen und eine weitere verdünnte Stammlösung mit 5 μg/ml herzustellen, indem 0,5 ml in einen 50-ml-Messkolben überführt wurden. Deionisiertes Wasser wird auch verwendet, um die endgültigen Arbeitslösungen zu erhalten, indem 0,1 ml des C-Dots-Reagens und verschiedene Volumina der Arzneimittelstammlösung in einen Satz 10-ml-Messkolben überführt und mit entionisiertem Wasser auf das Volumen aufgefüllt werden.

Um eine Kalibrierungskurve für NTX zu erstellen, wurden Arbeitslösungen hergestellt, indem genaue Volumina aus der NTX-Standardstammlösung, die den Konzentrationsbereich 15 × 10–3–15,00 µg/ml abdeckte, in einen Satz 10-ml-Messkolben und 0,1 ml C überführt wurden In jeden Kolben wurde eine Punktlösung gegeben. Die Lösungen wurden gemischt und das Volumen mit entionisiertem Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Die Fluoreszenzintensität der Arbeitslösungen wurde bei λ-Emission = 416 nm (λ-Anregung = 345 nm) gemessen. Die Ablesungen wurden aus den entsprechenden Ablesungen eines Rohlings abgeleitet, der der gleichen Behandlung unterzogen worden war. Durch Auftragen der Differenz der Fluoreszenzintensität gegen die entsprechenden NTX-Konzentrationen (μg/ml) wurde ein Kalibrierungsdiagramm erstellt.

Um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 500 μg/ml herzustellen, wurde ein Volumen von 2,5 ml Nanazoxid®-Suspension zum Einnehmen genau in einen 100-ml-Messkolben überführt. Um NTX zu extrahieren, wurden 50 ml Acetonitril zur oralen Suspension gegeben, 15 Minuten lang beschallt, abkühlen gelassen, mit dem gleichen Lösungsmittel (Acetonitril) bis zur Marke aufgefüllt und dann filtriert. Anschließend wurden präzise Mengen der filtrierten Lösung mit entionisiertem Wasser verdünnt, um Probenlösungen mit Konzentrationen im Linearitätsbereich zu erhalten.

Zwanzig Nanazoxid®-Tabletten mit der Aufschrift „500 mg NTX“ wurden gewogen, um das Durchschnittsgewicht der Tabletten zu berechnen. Nachdem die Tabletten gemahlen waren, wurde das durchschnittliche Gewicht des Pulvers in einen 100-ml-Messkolben überführt. Um den Wirkstoff zu extrahieren, wurden dem Pulver 50 ml Acetonitril zugesetzt, 15 Minuten lang beschallt, abkühlen gelassen, mit Acetonitril bis zur Marke aufgefüllt und dann filtriert. In einen 100-ml-Messkolben wurden 10 ml der filtrierten Lösung überführt und mit Acetonitril verdünnt, um eine Stammlösung des Arzneimittels mit einer Endkonzentration von 500 µg/ml zu erhalten. Entionisiertes Wasser wurde verwendet, um die vorherige Lösung zu verdünnen, um Probenlösungen mit Endkonzentrationen innerhalb des oben angegebenen Linearitätsbereichs zu erhalten, und sie wurden unter Verwendung des unter „Erstellung der Kalibrierungskurve“ beschriebenen Verfahrens analysiert. Abschließend wurden die prozentualen Rückgewinnungen berechnet.

Die Methode von Shalan et al.17 wurde für die TX-Herstellung angepasst. TX wurde durch saure Hydrolyse von NTX erhalten, wobei 50 ml 1 M HCl zu 50 mg NTX hinzugefügt wurden. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei 100 °C unter Rückfluss erhitzt. Die TX-Präparation wurde durch Auftüpfeln auf Kieselgel-60F254-TLC-Platten bestätigt und mit Chloroform: Methanol: NH3-Lösung: Essigsäure im Verhältnis 95:5:1:1 v/v und pH 5,8 entwickelt. Der gebildete Niederschlag wurde filtriert und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Das getrocknete Pulver wurde dann in den folgenden Experimenten verwendet.

Für menschliches Plasma, das mit unterschiedlichen Mengen NTX oder TX versetzt war, wurden Standardkalibrierungskurven erstellt. Aliquots von 200 μl Plasma wurden in eine Reihe von Zentrifugationsröhrchen überführt. Aliquots der Standardlösung von NTX oder TX wurden zugegeben, um eine Endkonzentration im Bereich von 0,015–5 μg/ml zu ergeben. Die Mischungen wurden verwirbelt und 0,5 ml Acetonitril wurden zur Proteinfällung zugegeben. Die Röhrchen wurden 1 Minute lang gevortext und dann 3 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Der klare Überstand wurde dann quantitativ in 5-ml-Messkolben überführt und mit entionisiertem Wasser auf sein Volumen aufgefüllt. Kalibrierungskurven wurden nach dem unter „Erstellung der Kalibrierungskurve“ beschriebenen Verfahren erstellt. Gleichzeitig wurde ein Blindversuch vorbereitet. Der Unterschied in der Fluoreszenzintensität wurde dann gegen die Endkonzentration aufgetragen, um die Kalibrierungskurve zu erhalten. Daraufhin wurden die entsprechenden Regressionsgleichungen abgeleitet. Proben menschlichen Plasmas, versetzt mit unterschiedlichen Mengen an NTX oder TX, wurden wie oben beschrieben hergestellt und die gewonnenen Gehalte jedes Arzneimittels wurden unter Verwendung der entsprechenden Regressionsgleichung quantifiziert.

Die Fluoreszenzquantenausbeute der synthetisierten C-Punkte wurde unter Verwendung von Chininsulfat als Referenz, aktiviert mit 345 nm UV-Licht, erreicht. Er wird mit 73,0 %24 berechnet. Bei Verwendung von in Dimethylsulfoxid gelöstem 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) als Zweitstandard errechnet sich eine Quantenausbeute von 71,2 %. Diese Ergebnisse zeigen, dass die hergestellten C-Punkte eine relativ hohe Quantenausbeute (mindestens 70 %) aufweisen24.

Die optischen Eigenschaften der synthetisierten C-Punkte wurden mittels Fluoreszenzspektroskopie und UV-Vis-Absorption bewertet. Die Fluoreszenz der synthetisierten C-Punkte wurde gemessen. Abbildung 1b zeigt sein Fluoreszenzspektrum bei einer Emissionswellenlänge von 416 nm nach Anregung bei 345 nm, was die Aussage von Abd Elhaleem et al. bestätigt. veröffentlichte Arbeit22. Während bei der Zugabe von 5 µg/ml NTX zur C-Punkte-Lösung eine deutliche Löschung der Fluoreszenz der C-Punkte auftritt, wie in Abb. 1b dargestellt. Darüber hinaus wurde das UV-sichtbare Absorptionsspektrum der vorbereiteten C-Punkte aufgezeichnet (Abb. 1c), das zwei Hauptpeaks bei 212 und 345 nm zeigte.

Um die Struktur der synthetisierten C-Punkte zu bestätigen, wurde das Fourier-Transformations-Infrarotspektrum (FTIR) der C-Punkte gemessen. Die Ergebnisse sind in Abb. 2a dargestellt. Das Fourier-Transformations-Infrarotspektrum (FTIR) der synthetisierten C-Punkte zeigte eine N-H-Streckschwingung bei 3418 cm−1. Die Carbonyl-OH-Streckschwingung wurde durch eine sehr breite Absorptionsbande von 3400 bis 2500 cm−1 verursacht. Die S-H-Streckschwingung wurde bei 2578 cm−1 beobachtet. Die C=O-Streckschwingung für Carbonsäure wurde bei 1713 cm-1 und für Amidcarbonyl (Amid I) bei 1634 cm-1 beobachtet. Die C=N-Streckschwingung (Amid-II-Bande) wurde 1544 cm-1 zugeordnet. Darüber hinaus wurde eine TEM-Bildgebung durchgeführt, um die morphologischen Merkmale und die Größe der C-Punkte zu untersuchen. Abbildung 2b zeigt, dass die synthetisierten C-Punkte kugelförmig sind und der Bereich der Partikelgrößenverteilung 2,18–9,8 nm beträgt.

(A) FTIR-Spektrum der vorbereiteten C-Punkte und (B) TEM-Bilder von C-Punkten.

Es gibt verschiedene Methoden, die zu einer Fluoreszenzlöschung führen können, z. B. dynamisches Löschen, statisches Löschen und der innere Filtereffekt (IFE)37. In dieser Studie zeigte das Absorptionsspektrum des Arzneimittels ein hohes Maß an Überlappung mit dem Anregungsspektrum der vorbereiteten C-Punkte. Dies ist in Abb. 3a dargestellt. Daher ist es möglich, dass IFE der Löschmechanismus ist37. Um den Effekt des inneren Filtereffekts zu untersuchen, wurde die korrigierte Fluoreszenzintensität gemäß der folgenden Gleichung berechnet35,37:

Dabei ist Fcorrected die korrigierte Fluoreszenzintensität nach Entfernung von IFE, Fobserved die beobachtete Fluoreszenzintensität und Aex und Aem die Absorption von NTX bei den Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen der C-Punkte.

(A) Absorptionsspektrum von NTX überlagert mit dem Anregungsspektrum von C-Punkten, (B) Effizienz (%E) der beobachteten und korrigierten Fluoreszenz von C-Punkten nach Zugabe verschiedener NTX-Konzentrationen und (C) Stern-Volmer-Diagramm von die Wechselwirkung von NTX mit C-Punkten bei verschiedenen Temperaturen (25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C).

Anschließend wurde die unterdrückte Effizienz (%E) für die korrigierte und beobachtete Fluoreszenzintensität unter Verwendung der folgenden Gleichung35,37 berechnet.

wobei F und F0 die Emissionsintensitäten der NTX-C-Punkte-Mischung bzw. der C-Punkte allein sind. Es wurde ein Diagramm von %E gegen die NTX-Konzentration erstellt. Die in Abb. 3b dargestellten Ergebnisse zeigten einen Verlust der Unterdrückungseffizienz, der bestätigt, dass IFE der Hauptauslöser für die Löschung der Fluoreszenz von C-Punkten durch NTX ist.

Neben IFE können auch andere Mechanismen auftreten. Die Stern-Volmer-Gleichung wurde verwendet, um die anderen möglichen Mechanismen zu bestimmen, die für die Löschung der nativen Fluoreszenz von C-Punkten verantwortlich sein könnten .

Dabei stellen F0 und F die Fluoreszenzintensitäten in Abwesenheit bzw. Anwesenheit des Arzneimittels dar, Ksv stellt die Stern-Volmer-Löschkonstante dar und [NTX] ist die molare Konzentration des Arzneimittels.

Sowohl die statische als auch die dynamische Löschung erfolgt aufgrund der molekularen Wechselwirkung zwischen dem Fluorophor und dem Löscher. Beim dynamischen Quenchen muss der Quencher im angeregten Zustand zum Fluorophor diffundieren. Durch das Abschrecken verändern sich die Moleküle nicht dauerhaft. Beim statischen Quenchen entsteht eine nicht fluoreszierende Verbindung zwischen dem Quencher und dem Fluorophor. Die Löschung kann durch Prozesse im angeregten Zustand, Bildung von Grundzustandskomplexen, molekulare Umlagerungen, Stoßlöschung, Energie-/Elektronentransfer und Zerstörung von Emissionsgruppen erfolgen49,50.

Um zwischen statischem und dynamischem Abschrecken zu unterscheiden, wurde die Temperaturabhängigkeit des Stern-Volmer-Diagramms untersucht50. Der Ksv-Wert steigt bei dynamischer Abschreckung mit steigender Temperatur, während er bei statischer Abschreckung mit steigender Temperatur abnimmt37. Die Kollisionsabschreckung findet bei höheren Temperaturen statt, da die Diffusion schneller erfolgt. Andererseits ist die statische Löschung bei höheren Temperaturen im Allgemeinen weniger wirksam, da schwach gebundene Komplexe dissoziieren50. Zu diesem Zweck wurden fünf verschiedene NTX-Konzentrationen bei verschiedenen Temperaturen (25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C) gemessen und die erhaltenen Stern-Volmer-Diagramme verglichen (Abb. 3c). Die in Abb. 3c dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die aus allen Diagrammen erhaltene Ksv-Konstante ~ 0,022 L mol−1 betrug und durch den Temperaturanstieg nicht beeinflusst wurde. Dadurch werden sowohl statisches als auch dynamisches Löschen ausgeschlossen, sodass IFE als erwarteter Löschmechanismus verbleibt21. Zur weiteren Bestätigung des aufgeklärten Mechanismus wurden die UV-Absorptionsspektren für NTZ, C-Punkte und die NTZ-C-Punkte-Mischung aufgezeichnet (Abb. 4a). Es wurden keine neuen Absorptionspeaks beobachtet, was unterstreicht, dass es sich beim Löschmechanismus nicht um ein statisches Löschen handelt33, 35.

(A) Absorptionsspektren von C-Punkten, NTX und NTX/C-Punkte-Gemischen und (B) Fluoreszenzemissionsspektren von 0,1 ml C-Punkten in wässriger Lösung nach Zugabe verschiedener NTX-Konzentrationen (0,0–15,0 μg/ml). Der Einschub stellt die entsprechende Kalibrierungskurve dar.

Die Reaktionsbedingungen wurden untersucht, um die größtmögliche Löschung des analysierten Arzneimittels zu erreichen. Verschiedene experimentelle Faktoren wurden optimiert. Die untersuchten Parameter waren: Art und pH-Wert des Puffers, Puffervolumen, Wirkung der Zugabe verschiedener Tenside, Reaktionszeit und Wirkung des Verdünnungslösungsmittels.

Es wurden sowohl Borat- (25 mM) als auch Phosphatpuffer (25 mM) untersucht. Die Auswirkungen unterschiedlicher pH-Werte für beide Puffer (pH 3, 5, 7 und 10) (Abb. S1a und b in ergänzenden Informationen) und unterschiedlicher Volumina Boratpuffer pH 7 (2–8 ml in 2-ml-Schritten) (Abb. S1c). in ergänzenden Informationen) zur Löschung von NTX-C-Punkten wurden untersucht und mit der Löschung von NTX-C-Punkten in wässrigen Lösungen verglichen. Die in Abb. S1 gezeigten Ergebnisse zeigen keine wesentliche Verbesserung der C-Punkt-Löschung bei Verwendung beider Puffer. Daher hatte der pH-Wert keinen signifikanten Einfluss auf die Löschung der C-Punkte durch das untersuchte Arzneimittel. Als Verdünnungslösungsmittel wird dementsprechend entionisiertes Wasser verwendet. Dies wird die Einfachheit und Umweltfreundlichkeit der vorgeschlagenen Methode erhöhen.

In einer zuvor veröffentlichten Studie wurde über die synergistische Wirkung des Tensids Natriumdodecylsulfat auf die Fluoreszenz von C-Punkten berichtet51. Daher wurden den gemessenen Lösungen verschiedene kationische, anionische und nichtionische Tenside zugesetzt, um die Löschwirkung von NTX zu untersuchen. Als kationische, anionische und nichtionische Tenside wurden Cetrimid, Natriumlaurylsulfat (SLS) und Tween 80 ausgewählt. Zur Untersuchung der Tensidwirkung wurden verschiedene Konzentrationen ausprobiert, indem die Konzentration für Cetrimid von 0,002 auf 0,008 M (Abb. S2a in den Zusatzinformationen), von 0,005 auf 0,02 M für SLS (Abb. S2b in den Zusatzinformationen) und von 0,2 % auf 0,8 geändert wurde % für Tween 80 (Abb. S2c in Zusatzinformationen). Die Fluoreszenzintensität der NTX-C-Punkte wurde bei jeder Konzentration aufgezeichnet und mit der Löschung der NTX-C-Punkte in wässrigen Lösungen verglichen. Die in Abb. S2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die beste Löschwirkung von NTX ohne Zugabe von Tensiden erzielt wurde. Daher wurde dem vorgeschlagenen Verfahren kein Tensid zugesetzt, was die Einfachheit und Umweltfreundlichkeit des Verfahrens erhöht.

Für die fluorimetrische Analyse wurde der Einfluss verdünnender Lösungsmittel untersucht. Verschiedene Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Acetonitril, Aceton, 0,1 M HCL, 0,1 M H2SO4, 0,1 M H3PO4, 0,1 M NaOH und entionisiertes Wasser wurden getestet. Wie in Abb. S3a in den Zusatzinformationen dargestellt, erzielte entionisiertes Wasser den besten Löscheffekt für die C-Punkte und maximierte die Assay-Empfindlichkeit. Dies kann auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass polarere Lösungsmittel wie entionisiertes Wasser die π-π*-Übergangsenergie verringern und die n-π*-Übergangsenergie maximieren, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität des Reagens führt52. Daher wurde entionisiertes Wasser als Verdünnungslösungsmittel für den Test gewählt, was die Methode einfacher, kostengünstiger und vor allem umweltfreundlicher machte.

Der Einfluss der Reaktionszeit auf die Zugabe von NTX zu C-Punkten wurde in verschiedenen Zeitintervallen von null bis 30 Minuten getestet. Die Fluoreszenzintensität der NTX-C-Punkte-Mischung wurde alle 5 Minuten gemessen (Abb. S3b in Zusatzinformationen). Es wurde beobachtet, dass bei Zugabe des Arzneimittels zu den C-Punkten sofort (zum Zeitpunkt Null) eine sofortige Reaktion stattfindet. Darüber hinaus war die Reaktionsmischung 30 Minuten lang stabil. Folglich zeigte sich, dass die Inkubation des Arzneimittels mit den C-Punkten über einen längeren Zeitraum keinen Einfluss auf die Löschung der C-Punkte hatte und die Reaktion somit einfacher und schneller wurde.

Zur Validierung der Leistung der vorgeschlagenen Methode wurden die Q2(R)1-Richtlinien des International Council on Harmonization (ICH) zur Validierung analytischer Verfahren befolgt53. Die Validierungsparameter sind in den Tabellen 1 und S1 in den Zusatzinformationen dargestellt.

Um die Linearität der vorgeschlagenen Methoden zu beurteilen, wurden unterschiedliche Konzentrationen des Arzneimittels unter den oben genannten optimalen Bedingungen analysiert. Die Fluoreszenzintensität der C-Punkte wurde über den Konzentrationsbereich gemessen; 15 × 10–3–15,00 µg/ml. Abbildung 4 zeigt die resultierende Löschung der C-Punkt-Fluoreszenz bei Zugabe verschiedener NTX-Konzentrationen. Für die Regressionsanalyse wurde die Methode der kleinsten Quadrate angewendet und verschiedene Werte wie Korrelationskoeffizienten (r), Achsenabschnitte (a), Steigungen (b), Standardabweichung des Achsenabschnitts (Sa) und Steigung (Sb) berechnet. Tabelle 1 zeigt alle statistischen Werte für die vorgeschlagene Methode. Die Ergebnisse zeigen, dass ein gutes lineares Kalibrierungsdiagramm erstellt wurde; Dies wurde durch die großen Werte der Korrelationskoeffizienten (Korrelationskoeffizientenwert > 0,999) und des RSD % der Steigung (Sb %) bestätigt, die 2 % nicht überstiegen. Darüber hinaus bestätigt der niedrige signifikante F-Wert die geringe Streuung der experimentellen Punkte um die Regressionslinie. Ebenso beweist die kleine Reststandardabweichung (Sy/x), dass die aufgetragenen Punkte sehr nahe an der Geraden liegen, was die gute Linearität der vorgeschlagenen Methode bestätigt.

Die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) wurden anhand der in den ICH-Richtlinien bereitgestellten Gleichungen berechnet. Wobei LOD = 3,3 S/b und LOQ = 10 S/b, wobei S die Standardabweichung (SD) von sechs Blindlösungen (d. h. sechs C-Punkt-Lösungen) und b die Steigung der Kalibrierungskurve ist. Die niedrigen berechneten Werte für LOD und LOQ weisen auf eine gute Empfindlichkeit der vorgeschlagenen Methode hin (Tabelle 1).

Drei separate Konzentrationen wurden analysiert, wobei jeweils drei Wiederholungsbestimmungen am selben Tag durchgeführt wurden, um die Präzision und Genauigkeit innerhalb eines Tages zu untersuchen. In ähnlicher Weise wurden die Präzision und Richtigkeit zwischen den Tagen untersucht, indem dieselben drei Konzentrationsniveaus analysiert wurden, wobei jeweils drei Wiederholungsbestimmungen durchgeführt wurden, die an drei aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt wurden. Die Genauigkeit der Methode wurde durch die zufriedenstellende prozentuale Wiederfindung (% Wiederfindung) (99–101,4 %) und die kleinen Werte des prozentualen relativen Fehlers (%Er) bestätigt, die 2 % nicht überstiegen. Außerdem wurde die Präzision der Methodik durch die niedrigen Werte der prozentualen relativen Standardabweichung (%RSD) bewertet und nachgewiesen, die 2,0 % nicht überstiegen, was die hohe Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der entwickelten Methode zur Schätzung von NTX in Massenform unterstreicht (Tabelle S1). ).

Die Selektivität der vorgeschlagenen Methode wurde untersucht, indem die dämpfende Wirkung einiger gleichzeitig verabreichter Medikamente beobachtet wurde, wie Ribavirin und Remdesivir, die zur Behandlung von COVID-199,10,11 verwendet werden, und Clarithromycin, das bei der Behandlung von H- eingesetzt wird. Pylori-Infektion54. Bei Anwendung der vorgeschlagenen Methode zeigten alle getesteten Verbindungen keine Löschwirkung auf die verwendeten C-Punkte. Darüber hinaus störten die normalerweise in den pharmazeutischen Präparaten enthaltenen Hilfsstoffe und Zusatzstoffe die vorgeschlagenen Methoden nicht, wie die in Tabelle 2 dargestellten guten prozentualen Wiederfindungen zeigen. Diese Studien unterstützen die Selektivität und Spezifität der entwickelten Methodik.

Das vorgeschlagene Verfahren wurde für die Bestimmung von NTX in den auf dem lokalen Markt erhältlichen Dosierungsformen angewendet. Nanazoxid®-Filmtabletten (500 mg) und Nanazoxid®-Suspension zum Einnehmen (100 mg/5 ml) wurden mithilfe der vorgeschlagenen fluorimetrischen Methode quantitativ geschätzt. Die prozentualen Rückgewinnungen wurden mithilfe der externen Standardmethode berechnet. Gute Testergebnisse zeigten eine akzeptable Genauigkeit und Präzision, wie die in Tabelle 2 dargestellten Werte für Wiederfindung %, SD, RSD % und Er % veranschaulichen. Die Dosierungsformen, andere coformulierte Hilfsstoffe und Zusatzstoffe hatten keinen Einfluss auf den NTX-Test. Folglich zeigte die entwickelte Methode in Gegenwart anderer co-formulierter Inhaltsstoffe eine angemessene Spezifität und Zuverlässigkeit.

Die Methode wurde erfolgreich für die Analyse von NTX und TX in dotiertem Humanplasma eingesetzt. Abbildung 5 zeigt die resultierende Löschung der C-Punkt-Fluoreszenz nach Zugabe von menschlichen Plasmaproben, die mit 2 μg/ml NTX (Abb. 5a) und 2 μg/ml TX (Abb. 5b) versetzt waren. Unter den oben beschriebenen experimentellen Bedingungen wurde eine lineare Korrelation durch Auftragen der Differenz der Fluoreszenzintensität gegenüber der Konzentration jeder Verbindung nachgewiesen. Nachdem die Daten einer linearen Regressionsanalyse unterzogen wurden, wurden die folgenden Gleichungen erhalten:

Dabei ist: FI der Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen dem Leerwert (d. h. C-Punkte) und den C-Punkten mit entweder NTX- oder TX-Zusatz, C die Arzneimittelkonzentration (μg/ml) und r der Korrelationskoeffizient. Hohe Korrelationskoeffizientenwerte weisen auf eine gute Linearität der Kalibrierungskurven hin. Die statistische Analyse der Daten zeigte einen geringen relativen Fehlerprozentsatz (Er%), wie in Tabelle 3 dargestellt.

(A) Fluoreszenzemissionsspektren von 0,1 ml C-Punkten in wässriger Lösung nach Zugabe von 2 μg/ml NTX, versetzt in menschliches Plasma und (B) Fluoreszenzemissionsspektren von 0,1 ml C-Punkten in wässriger Lösung nach Zugabe von 2 μg/ml TX stieg im menschlichen Plasma an.

Die Leistungsfähigkeit der vorgeschlagenen Methode wurde durch ihre Anwendbarkeit auf menschliches Plasma demonstriert, das mit vier verschiedenen Konzentrationen jeder Verbindung versetzt und mithilfe der entsprechenden Regressionsgleichung bestimmt wurde. Die Testergebnisse für die NTX- und TX-Bestimmung in dotiertem Plasma unter Verwendung des vorgeschlagenen fluorimetrischen Protokolls sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

Heutzutage besteht großes Interesse an den Auswirkungen chemischer Prozesse auf Umwelt und Gesundheit. Um potenzielle Umweltrisiken vollständig auszuschließen, war es wichtig, die Umweltverträglichkeit der Analysemethoden zu ermitteln. Wir verwendeten das Eco-Scale-Schätztool, eine halbquantitative Technik, die auf der Bestimmung der mit dem Global Harmonisierten System (GHS) vereinbarten Strafpunkte für die Chemikalienkennzeichnung, das Berufsrisiko, die Behandlungsmethode, den Energieverbrauch und das Abfallvolumen basiert . Die gesamten Strafpunkte werden von „100“, dem besten Greenness-Wert, abgezogen. Der mit der vorgeschlagenen Methode berechnete Wert betrug 87, was einen perfekten Grünwert ergab (Tabelle 4)47. Kürzlich wurde eine andere Methode (AGREE-Bewertung) verwendet, um eine unparteiische Bewertung der Umweltauswirkungen der vorgeschlagenen Methodik zu ermöglichen48. Um die 12 Prinzipien der grünen analytischen Chemie darzustellen, stellt AGREE ein uhrförmiges Diagramm mit 12 getrennten Abschnitten zur Verfügung. Jeder Teil bezieht sich separat auf ein Prinzip, das je nach Grüngrad des Analyseverfahrens rot, gelb und grün färbt. Der Gesamtbewertungswert wird in der Mitte des AGREE-Diagramms auf einer Skala von 0 bis 1 angezeigt (Tabelle 4). Die Bewertungen von AGREE und Eco-Greenness Scale stützten die gleichen Ergebnisse.

Abdel-Lateef et al. berichteten über eine spektrofluorometrische Methode zur Quantifizierung von NTX20, die auf der Oxidation von NTX (nicht fluoreszierend) zu einem stark fluoreszierenden Produkt durch Natriumhypochlorit basiert. Währenddessen haben Qandeel et al.21 pflanzensynthetische Quantenpunkte für die Analyse von NTX in Kapsel-Darreichungsformen verwendet. Tabelle 4 zeigt einen Vergleich unserer vorgeschlagenen Methode mit anderen zuvor veröffentlichten Methoden. Die Ergebnisse zeigen, dass unsere vorgeschlagene Methode sehr empfindlich ist. Diese hohe Empfindlichkeit ermöglichte die selektive Bestimmung von TX, dem Hauptmetaboliten von NTX, in menschlichen Plasmaproben. Damit ist diese Studie die erste spektrofluorimetrische Methode in der Literatur, die TX in menschlichen Plasmaproben bestimmt. Darüber hinaus bietet das vorgeschlagene Verfahren weitere Vorteile, da es kostengünstig und einfach ist und keine langwierigen mehrstufigen Verfahren erforderlich sind. Darüber hinaus erfordert die vorgeschlagene Methode keine teure Instrumentierung oder komplexe analytische Reagenzien. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Wasser als Verdünnungslösungsmittel, dass die entwickelte Methode ein umweltfreundlicherer Ersatz für die anderen zuvor beschriebenen Methoden20,21 ist, wie in Tabelle 4 gezeigt. Dies beweist, dass unsere vorgeschlagene Methode umweltfreundlicher ist. Außerdem kann die vorgeschlagene Methode bei der Prüfung der Arzneimittelreinheit und der routinemäßigen Qualitätskontrollanalyse hilfreich sein. Darüber hinaus bietet es maximale Empfindlichkeit, ohne dass eine schwierige oder teure Instrumentierung erforderlich ist.

Die Kombination zwischen der Verwendung der spektrofluorimetrischen Technik und dem Quantenpunkt-Nanosensor ergibt eine hochempfindliche, schnelle und praktikable Methode zur empfindlichen Bestimmung von NTX im Konzentrationsbereich von 15 × 10–3–15,00 µg/ml. Es war möglich, mit Stickstoff und Schwefel dotierte CQDs mit sicheren und hohen Ausbeuten herzustellen, die viel Stickstoff und Schwefel auf ihrer Oberfläche aufwiesen, indem eine wässrige Lösung von Zitronensäure mit L-Cystein hydrothermal umgesetzt wurde. C-Punkte fungieren als wünschenswerte lumineszierende Nanosensoren für die selektive und empfindliche Bestimmung von NTX. Abhängig vom Bedarf an sehr geringen Mengen organischer Lösungsmittel und der Verwendung von Wasser als Verdünnungslösungsmittel ist die entwickelte Methode äußerst umweltfreundlich und umweltfreundlich. Die native C-Punkt-Fluoreszenz wurde durch komplementäre Überlappungen der NTX-Absorptionsbande mit den Anregungsfluoreszenzspektren der C-Punkte effizient gelöscht, was zu einem inneren Filtereffekt führte. Es wurde nachgewiesen, dass der innere Filtereffekt der zugrunde liegende molekulare Mechanismus der Löschung ist. Die offensichtlichen Vorteile der validierten vorgeschlagenen Methode sind Umweltfreundlichkeit, Einfachheit, Zuverlässigkeit und niedrige Kosten. Darüber hinaus zeigte die Methode eine hohe Empfindlichkeit, die die Bestimmung von NTX in verschiedenen pharmazeutischen Dosierungsformen ohne Vorbehandlung oder Einfluss der üblichen Hilfsstoffe ermöglichte. Darüber hinaus gilt diese Methode als die erste spektrofluorimetrische Methode, die sowohl NTX als auch seinen Hauptmetaboliten TX in menschlichen Plasmaproben mit hoher Selektivität bestimmt. Daher können die vorgeschlagenen lumineszierenden Nanosensoren als den zuvor beschriebenen spektrofluorimetrischen Methoden überlegen angesehen werden.

Alle Daten sind auf Anfrage erhältlich. Für alle für die durchgeführte Studie erforderlichen Daten sollte der entsprechende Autor kontaktiert werden.

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Mahmoud A. Ragab

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HME-Überwachung, Konzeptualisierung, Methodik, Datenanalyse, Datenkuratierung und -schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Überprüfung und Bearbeitung. MME-Methodik, Datenanalyse, Datenvalidierung, Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs TSB-Überwachung, Konzeptualisierung, Methodik, Datenkuration, Untersuchung und Schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Überprüfung und Bearbeitung. MAR-Synthese und Charakterisierung des C-Punkt-Reagenzes. AFE-Überwachung, Konzeptualisierung, Methodik, Datenanalyse, Datenkuratierung und -schreiben – Vorbereitung des Originalentwurfs, Überprüfung und Bearbeitung.

Korrespondenz mit Amira F. El-Yazbi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Elbardisy, HM, Elnaggar, MM, Belal, TS et al. Grüne „abschaltbare“ lumineszierende Nanosensoren für die empfindliche Bestimmung stark fluoreszierender antibakterieller antiviraler Wirkstoffe und ihrer Metaboliten in verschiedenen Matrizen. Sci Rep 13, 14131 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40946-4

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Eingegangen: 26. März 2023

Angenommen: 18. August 2023

Veröffentlicht: 29. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40946-4

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